HRP标記難，您選對(duì)試劑盒了(le)嗎(ma)？

一(yī)、引言

為(wèi)了(le)在WB/IHC/IF等免疫學實驗中進行(xíng)特異性蛋白(bái)的¶₩γ∞(de)檢測，需要(yào)在抗體(tǐ)或蛋白(bái)質上(shàng)偶聯上(shàng)酶、熒光(>♦£≈guāng)素、生(shēng)物(wù)素、膠體(tǐ)金(jīn)等追蹤物(wù)，并借助于熒光(guāng)顯微(wēi)鏡、酶标檢測儀或電(diàn)子(zǐ)顯微(wēi)鏡£δ↑<等精密儀器(qì)對(duì)試驗結果進行(xíng)測定☆₩"，從(cóng)而可(kě)以在細胞、亞細胞、超微(w₽‌​ēi)結構及分(fēn)子(zǐ)水(shuǐ)平上(shàng)進行(xíng)定性和(hφ×$₩é)定位研究，也(yě)可(kě)應用(yòng)于各種液相(xiàng)和♦®(hé)固相(xiàng)免疫分(fēn)析中。

免疫酶标記技(jì)術(shù)是(shì)将抗原和(hé)抗體(tǐ)的(de)免疫反應和(h★<<é)酶的(de)催化(huà)反應相(x₩εβiàng)結合而建立的(de)一(yī)種新技(jì‍♥→)術(shù)，酶與抗體(tǐ)或抗原結合後，既不(bù)改變抗體(tǐ)或抗原的(de)≤$免疫學反應的(de)特異性，也(yě)不(bù)影(yǐng)響酶本身(shēn)的(de)酶學活性。酶₹↑​标記中，常用(yòng)的(de)就(jiù)是(shì)辣根過氧化(h×≈uà)物(wù)酶（HRP），HRP能(néng)通(tōng)過催化(huà)有(yǒu)過氧化(huà)氫參與的(de)一•←(yī)系列氧化(huà)還(hái)原反應并釋放(fàng)信号，因此被廣泛應用(yòng)于免疫印迹(WB)，酶聯免疫吸附 (ELISA)，以及免疫組織化(huà)學 (IHC) 等實驗中。

辣根過氧化(huà)物(wù)酶HRP上(shàng)的(de)糖羟基可(kě)以被高(gāo±§ε)碘酸鈉活化(huà)生(shēng)成醛基，這(zhè)些(xiē)醛基能(néng)通(tōng)過Schiff堿與蛋白(bái)中的(de)氨基偶聯，緊接著(zhe)還(hái)原Schiff堿形成穩定的(de)偶聯産物(wù)。雖然這(zhè)種HRP标記方法已經被廣泛認可(kě)和(hé)應用(yòng)，但(↔λdàn)是(shì)也(yě)存在一(yī)定的(de)缺陷，标記過程較為& (wèi)繁瑣和(hé)耗時(shí)，而且标記後酶的(de)活性容易丢✘₹✘失。洛陽佰盛生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù★<♣)有(yǒu)限公司提供了(le)一(yī)種簡單快(kuài)速的(de)HRP标記試劑盒。能(néng)夠解決現(xiàn)有(yǒu)标記方法☆"★ 的(de)這(zhè)些(xiē)缺陷。

圖1：HRP快(kuài)速标記試劑盒（洛陽佰盛生(™♣shēng)物(wù)）

二、标記原理(lǐ)與應用(yòng)

高(gāo)碘酸鈉氧化(huà)法活化(huà)辣根過氧∑♣化(huà)物(wù)酶（HRP）的(de)糖基，經過活化(huà)的(de)HRP帶有(yǒu)醛基可(kě)以與待标記物(wù)的(de)§ ↕遊離(lí)氨基結合，發生(shēng)希夫堿反應（Schiff's base reaction）。本試劑盒适用(yòng)于帶有(yǒu)遊離(lí)氨基的(de)物(wù)質的(de δ≠)标記，比如(rú)：帶有(yǒu)遊離(lí)氨基（伯胺）的(de)抗體(tǐ)、蛋✔♥™白(bái)或者小(xiǎo)分(fēn)子(zǐ)化(huà)•↕÷合物(wù)。

試劑盒內(nèi)包括：預活化(huà)HRP、标記啓動液、反應終止液幹粉、标記物(wù)保存液、備用(yòng)透析袋(MD6，截留量12KD）。

三、産品優勢

（1）活性強：可(kě)以标記100μg的(de)抗體(tǐ)或蛋白(bái)。

（2）标記效果好(hǎo)，标記率高(gāo)，标記後酶與抗體(tǐ)（蛋白(bái)）的(de)活性均無重大(d♦ ≤à)損失。

（3）穩定性高(gāo)：HRP以凍幹粉狀态-20℃能(néng)保存數(shù)年(nián‌∏≥)，但(dàn)在溶液中很(hěn)不(bù)穩定且易失活（7天不(bù)失活），洛陽佰盛生(shēng →↑)物(wù)制(zhì)備的(de)試劑盒采用↕₽λΩ(yòng)特有(yǒu)穩定技(jì)術(shù)，預活化(huà)的(de±<)HRP在液體(tǐ)環境中4℃條件(jiàn)下(xià)可(kě)以保證1年(nián)內(nèi)開(kāi)啓有(yǒu)效。克服了(le)HRP在液體(tǐ)中的(de)不(bù)穩定性。

（4）操作(zuò)過程快(kuài)捷、簡單，活化(huà)後的(de)HRP保存在液體(tǐ)中，吸取方便，無須柱純化(huà)步驟。

（5）利用(yòng)率高(gāo)：與凍幹形式的(de)活化(huà)HRP相(xiàng)比，能(néng)夠穩定保存>≈¥®在液體(tǐ)中的(de)活化(huà)HRP減少(shǎo)了(le)複溶過程及複溶後用(yòng)不✔♥(bù)完廢棄造成的(de)浪費(fèi)，可(kě)以用☆β∏©(yòng)多(duō)少(shǎo)吸取σ§多(duō)少(shǎo)，幾乎不(bù)會(huì)産生(shēnβγ"g)損耗。

四、标記操作(zuò)步驟

 （1）首先去(qù)除待标記抗體(tǐ)或蛋白(bái)中的(de)疊氮鈉、以及含有(yǒu)氨基的'←♥(de)緩沖成分(fēn)物(wù)質，比如(rú)甘氨酸、Tris 等，還(hái)有(yǒu)EDTA等物(wù)質，可(kě)采用(yòng)透析和(hé)超濾的(de)辦法★←↑置換緩沖液，以去(qù)除幹擾物(wù)質達到(dào)好(hǎo)的(λ←>de)标記效果！透析或超濾緩沖液可(kě)選0.01M CB，PH:9.6緩沖液(0.01M CB，PH:9.6緩沖液配制(zhì)：取NaHCO3，0.67g和(hé)Na2CO3，0.21g加水(shuǐ)到(dào)1L溶解完全即可(kě)，不(bù)用(yòng)調節PH），若實驗室沒有(yǒu)碳酸鹽試劑再采用(yòn☆£g)0.01M PBS（PH:7.0～7.4均可(kě)）透析或超濾置換緩沖液，然後調整抗體(tǐ)或蛋白(bái)的(de)濃度到(dào)2mg/mL。如(rú)果抗體(tǐ)和(hé)蛋白(bái)$Ω不(bù)含上(shàng)述這(zhè)些(xiē)幹擾物(wφ&ù)質可(kě)以直接用(yòng)上(shàng)述PBS或CB緩沖液調整濃度到(dào)2mg/mL備用(yòng)。

（2）從(cóng)4℃取出HRP标記試劑盒，使各組分(fēn)充分(fēn)混勻。

（3）取500μL抗體(tǐ)或蛋白(bái)（約1mg），加入50μL預活化(huà)HRP(1mg)液體(tǐ)中，用(yòng)移液槍反複吹打幾次混勻，混勻後加入HRP标記啓動液99μL（加入啓動液量依據：

每10μL蛋白(bái)和(hé)HRP混合液加1.8μL啓動液）繼續混勻數(shù)次，避免産生(shēng)氣泡。然後避光(guāng)30℃～37℃溫箱偶聯反應2～3小(xiǎo)時(shí)，若遇快(kuài)要(yào)下(xià)班也(yě)可(kě)放(fàng)4℃反應24小(xiǎo)時(shí)左右（此法效果一(yī)樣或者更好(hǎo)不(bù)必擔心）。δ'

（4）偶聯結束将反應終止液粉管中加入1mL去(qù)離(lí)子(zǐ)水(shuǐ)混勻，取50μL加入3所述反應液中（加入終止液量依據：每1mg HRP加入終止液50μL），充分(fēn)混勻，室溫放(fàng)置1 小(xiǎo)時(shí)或者4℃ 2小(xiǎo)時(shí)。

（5）終止完成後，可(kě)直接加入等體(tǐ)積的(de)标記物(wù)保存液，充分(fēn)混勻，置于-20℃保存。如(rú)果想更上(shàng)長(chá≠♥ng)期的(de)保存建議(yì)先用(y™×"òng)0.067M PBS  PH:7.0（0.067M PBS， PH:7.0緩沖液配制(zhì)：取NaH2PO4.2H2O，5.35g和(hé)Na2HPO4.12H2O， 11.7g以及NaCL，9g加水(shuǐ)1L溶解完全，添加NaOH，0.35g再次混勻後即可(kě)，不(bù)用(yòng)再調節PH）透析或超濾置換緩沖液後再加标記物(wù)保存液。這(zhè)樣可(kě)以保存3年(nián)左右甚至更長(cháng)。

圖2：标記過程

五、标記注意事(shì)項

（1）待标記物(wù)緩沖液成分(fēn)過于複雜(zá)以及含有(yǒu)氨基小(xiǎo)¥↑Ω≥分(fēn)子(zǐ)和(hé)NAN3的(de)初始緩沖液必須透析或超濾置換掉，請(qǐng)采用(yòng)0.01M PBS（PH:7.0～7.4均可(kě)）或0.01M CB，PH:9.6緩沖液均可(kě)。

（2）如(rú)果待标記物(wù)不(bù)是☆‍(shì)抗體(tǐ)是(shì)其它蛋白(bái)，那(nà)麽請(qǐng)根據分(fēn)子(zǐ)量參考蛋白(bái)和(hé)酶用(yòng)$≈Ω∏量：若分(fēn)子(zǐ)量在40KD以上(shàng)建議(yì)1mg蛋白(bái)使用(yòng)1mg HRP；如(rú)果分(fēn)子(zǐ)量在30KD左右，建議(yì)1mg蛋白(bái)使用(yòng)1.3mg HRP；如(rú)果分(fēn)子(zǐ)量在20KD左右，建議(yì)1mg蛋白(bái)使用(yòng)2mg HRP；如(rú)果分(fēn)子(zǐ)量在10KD左右，建議(yì)1mg蛋白(bái)使用(yòng)4mg HRP；此時(shí)啓動液和(hé)終止液請(qǐ∏>✘ng)按步驟（3）和(hé)（4）描述标準适量加入；如(rú)果标記量為(wèi)小(xiǎo)于1mg的(de)抗體(tǐ)或蛋白(bái)（可(kě)以0.1mg），HRP和(hé)其它試劑加入量按比例折算(suàn)即可(k $ě)。

（3）小(xiǎo)分(fēn)子(zǐ)藥物(wù)不(bù)建議(yì)直接标記HRP，因為(wèi)HRP的(de)結構不(bù)能(néng)結合足夠的(de)藥物(wù₩←)會(huì)造

成效價偏低(dī)，這(zhè)種情況建議(yì)先偶聯BSA增加小(xiǎo)分(fēn)子(zǐ)偶聯量再進行(↑ εxíng)HRP标記，這(zhè)樣效果會(huì)非常好(hǎo)。

（4）如(rú)果待标記物(wù)含有(yǒu)其它蛋白(bᮧ​i)需要(yào)把無關蛋白(bái)同樣計(jì)算(suàn)進去(qù)，盡管如(rú)此也(yě)請(qǐng)您慎重選擇這(λ€£zhè)樣的(de)樣品進行(xíng)标記。

（5）本試劑盒保存4℃可(kě)以保證1年(nián)內(nèi)開(kāi)啓有(yǒu)效，活化(huà)HRP開(kāi)啓後小(xiǎo)心取用(yòng)切勿污染堿性物(wù)質。

（6）終止液幹粉一(yī)共5支，原則上(shàng)每一(yī)支配好(hǎo)後僅限一(yī)次性使用(yòn§σg)，可(kě)以根據實驗總量合理(lǐ)配制(zhì)使用(yòng)。

六、公司簡介

洛陽佰盛生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)有Ω× (yǒu)限公司位于十三朝古都(dōu)、牡丹花(huā)城(chéng)、中國(guó)曆史文↑≤(wén)化(huà)名城(chéng)洛陽市(shì)。主要(yào)從(cóng)‍¶↓事(shì)生(shēng)物(wù)診斷技(jì)術(sh∞ ₽ù)與材料的(de)研發、技(jì)術(shù)服務與技(jì)術(shù✘←÷↔)轉讓；相(xiàng)關技(jì)術(shù)與材∏σ料的(de)應用(yòng)範圍涵蓋食品安全檢測、₩♥動物(wù)疾病診斷、人(rén)類疾病診斷∏​‌§、抗體(tǐ)制(zhì)備、細胞培養及生(shēng)命科(kē)學儀器(qì)等。客σ•₽₽戶主要(yào)包括大(dà)學(食品科(kē)學院系、生(shēng)物(wù)技(jì)術(shù)↔★£院系、醫(yī)學院系)、科(kē)研機(jī)構、食品安全診斷試劑公司、動物(wù)疾病診斷試劑公司、人(rφδ→αén)類疾病診斷試劑公司。做(zuò)好(hǎo)基礎研發，助力祖國(guóσ$↕)科(kē)研是(shì)我們的(de)主"σ要(yào)目标。目前公司擁有(yǒu)或授權使用(yòng)的(de)商标有(yǒu "←)BIOABLAB\ABLAB。産品訂購(gòu)電(diàn)話(huà)：0379-60665856，18903798022。